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當使用傳統的透射（透射）明場(chǎng)照明技術(shù)在體視顯微鏡中觀(guān)察時(shí)，幾乎透明和無(wú)色的標本可能幾乎看不見(jiàn)。發(fā)生這種情況的原因是，當微小的樣品細節衍射的光在中間像面上重新組合時(shí)，與直接通過(guò)樣品的直射光異相四分之一波長(cháng)，這種經(jīng)典現象嚴重降低了明場(chǎng)圖像的對比度。

圖1-尼康斜相干對比度照明場(chǎng)

但是，如果照明的方向使其來(lái)自單個(gè)方位角并從傾斜角度照射到樣品，則與允許光線(xiàn)直接穿過(guò)樣品特征時(shí)相比，樣品中的細節可能具有更大的對比度和視覺(jué)清晰度。沿著(zhù)顯微鏡的光軸。樣品中的相位和折射率梯度會(huì )通過(guò)衍射，反射和折射來(lái)偏轉光線(xiàn)，因此只有零階（未衍射）和一到兩個(gè)衍射光的邊帶才能在像平面上重組。這將產(chǎn)生類(lèi)似于浮雕樣的樣本圖案，該區域具有顯示陰影和高光的區域，非常類(lèi)似于在復合顯微鏡中使用差分干涉對比（DIC）技術(shù)觀(guān)察到的那樣。

圖1中展示的是現代立體顯微鏡照明架（尼康斜相干對比（OCC）直徑模型），其設計目的是通過(guò)從軸向明場(chǎng)到高度傾斜的偏軸光線(xiàn)的過(guò)渡機制照亮標本，從而使透明標本可見(jiàn)在一個(gè)非常類(lèi)似于暗場(chǎng)的計劃中該支架包含一個(gè)高和低數值孔徑聚光鏡，可利用整個(gè)立體顯微鏡的物鏡放大倍率（通常為0.5x至2x）和數值孔徑（0.07至0.21）范圍。傾斜照明是通過(guò)滑動(dòng)光闌來(lái)實(shí)現的，該滑動(dòng)光闌遮擋光束的中心以產(chǎn)生部分相干的光源，該光源會(huì )傾斜地投射到樣本上，從而產(chǎn)生高對比度的圖像。

樣品放置在尼康OCC透濕鏡架的玻璃平臺上，并且可以通過(guò)旋轉光圈控制旋鈕在明場(chǎng)，暗場(chǎng)或不同程度的傾斜照明下進(jìn)行照明。在圖2中顯示了在連續傾斜照明水平上捕獲的一系列數字圖像，用于半透明的線(xiàn)蟲(chóng)（鉤蟲(chóng)；犬小血管瘤）） 標本。如圖2（a）所示，未染色的鉤蟲(chóng)是半透明的，在明場(chǎng)軸向照明下幾乎看不到任何細節。但是，當將滑動(dòng)膜片旋轉到光路中時(shí)，可以實(shí)現增加傾斜照明的程度（圖2（b），2（c）和2（d）），其中最極端的位置與暗場(chǎng)照明非常接近從單個(gè)方位角。通過(guò)比較圖2（a）和2（c）可以最明顯地描繪出這種照明支架可能產(chǎn)生的樣品對比度變化，圖2（a）和2（c）分別是在明場(chǎng)和高度傾斜的相干對比度下產(chǎn)生的。

圖2-OCC照明中的鉤蟲(chóng)（犬小血管瘤）

尼康斜體顯微鏡照明支架的主要設計標準之一是能夠增強圖像對比度（例如使用虹膜光闌可以實(shí)現的對比度），同時(shí)保持能夠與復消色差物鏡所顯示的相匹配的高聚光鏡數值孔徑。許多具有平行或公共主要物鏡（CMO）設計的體視顯微鏡都與裝有虹膜光闌的照明支架耦合，該虹膜隔板是內置的或作為附件提供的。當前與OCC透照支架兼容的尼康CMO設計立體顯微鏡包括SMZ25/SMZ18，SMZ1270/1270i和SMZ800N系列。為了增加景深，通常減小光圈孔徑的尺寸，這也用于增加透照照明中的圖像對比度。不幸的是，減小虹膜光圈的尺寸還使得成像光線(xiàn)更加連貫，并且通過(guò)減小物鏡的工作數值孔徑而損害了顯微鏡的分辨能力。

傾斜相干對比照明系統將傾斜照明的效果與通過(guò)減小聚光鏡孔徑光闌尺寸而獲得的相干增強相結合，并在立體顯微鏡中創(chuàng )建外觀(guān)類(lèi)似于復合顯微鏡產(chǎn)生的差分干涉對比圖像的圖像。傾斜相干對比系統使用擋板作為滑動(dòng)隔膜，而不是使用虹膜孔徑隔膜。如果物鏡保留了大部分分辨力，則線(xiàn)性光闌機構的行為就像在相同位置的光圈一樣。這可以實(shí)現，因為照明錐的數值孔徑減小了，而物鏡的數值孔徑?jīng)]有減小。

交互式教程-傾斜相干對比照明

通過(guò)透射光增強立體顯微鏡的對比度。

尼康斜體立體顯微鏡系統的照明路徑如圖3所示，該圖也顯示了正常明場(chǎng)（透鏡）條件下的光路。集光透鏡系統將燈絲的圖像聚焦到相對于燈和樣品光軸成45度角的鏡子上�；瑒�(dòng)膜片是一個(gè)擋板，可以在反射鏡的表面上平移，以阻擋通常直接穿過(guò)樣品的光，從而確保僅使用傾斜光來(lái)照亮樣品的細節。位于反射鏡上方的聚光鏡通過(guò)將擋板的銳利邊緣聚焦在物鏡的后焦平面上，從而保持照明的連貫性。

使用該系統，可以保持物鏡的整個(gè)數值孔徑。尼康傾斜系統的優(yōu)勢（相對于其他傾斜照明技術(shù)）之一是通過(guò)單個(gè)調節旋鈕（可控制滑動(dòng)擋板的位置）在明場(chǎng)，傾斜和暗場(chǎng)照明之間輕松轉換。擋板移離鏡子的情況下，樣品的外觀(guān)與正常明場(chǎng)照明下的外觀(guān)相同。隨著(zhù)擋板向上移動(dòng)到鏡子的頂部，圖像將類(lèi)似于暗場(chǎng)，并且在這些極端之間，獲得了真正的傾斜照明條件。傾斜度易于調整，以適合樣本和所需的細節類(lèi)型。

圖3-斜相干對比光路

傾斜照明在許多方面與暗場(chǎng)技術(shù)相似，不同之處在于，不是從各個(gè)方向以?xún)A斜角度照亮標本，而是僅從單個(gè)方位角投射光。已經(jīng)采用了多種照明方案來(lái)提供傾斜的定向照明，以利用體視顯微鏡觀(guān)察標本（示例如圖4所示）。簡(jiǎn)單的透濕式底座通常配備有可調節的傾斜鏡，以提供一定程度的傾斜照明，但光線(xiàn)不易控制且不能提供均勻的視野。更復雜的顯微鏡支架（或底座）具有更多的控制可能性，包括不限于單軸的傾斜鏡和可以插入光路或從光路中移出的滑動(dòng)鏡組件。

這些技術(shù)中的任何一種都可以在各種標本上提供令人滿(mǎn)意的出色結果，但是大多數技術(shù)都需要相當程度的操縱，涉及照明路徑，這通常很難定量分析或復制。立體顯微鏡中傾斜照明涉及的藝術(shù)比科學(xué)更多，因此高度依賴(lài)于顯微鏡專(zhuān)家的技能，經(jīng)驗和耐心。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多照明方案，這進(jìn)一步使圍繞該技術(shù)的問(wèn)題復雜化，以增強樣本對比度。

圖4-傾斜/明場(chǎng)立體顯微鏡支架

考慮到經(jīng)典復合顯微鏡通常所描述的傾斜照明技術(shù)，可以最好地理解傾斜照明增強原本幾乎看不見(jiàn)的無(wú)色樣品中細節的機理。來(lái)自子級聚光鏡一個(gè)方位角的直射光從一側照亮樣品。傾斜照明通常是通過(guò)將狹縫或扇形光闌放置在聚光鏡的下透鏡和孔徑光闌下方實(shí)現的，只允許傾斜光穿過(guò)光闌的狹窄開(kāi)口照亮樣品。傾斜照明的作用是將穿過(guò)樣本的光的零階偏移到物鏡孔徑的外圍。零階向一側的移動(dòng)使得衍射光的一個(gè)或多個(gè)另外的更高階（邊帶）能夠被包括在物鏡的后焦平面處并且有助于成像。在許多情況下，其結果是光學(xué)分辨率的提高，因為第零階和一些更高階均有助于成像。另外，該技術(shù)還產(chǎn)生具有陰影的高浮雕特征的圖像，該圖像使樣品在外觀(guān)上為偽三維。

與暗場(chǎng)技術(shù)相比，在暗場(chǎng)技術(shù)中，所有方位角均以高度傾斜的光進(jìn)行照明，而非對稱(chēng)傾斜照明所產(chǎn)生的圖像的特征高度取決于照明的入射角。由傾斜照明產(chǎn)生的圖像在使垂直于入射照明方向的邊緣可見(jiàn)的意義上是不對稱(chēng)的，而與該方向平行（或接近）的邊緣則不可見(jiàn)。對于相對于入射傾斜照明角度不同方向的兩個(gè)樣本，圖5中說(shuō)明了這一概念。圖5（a）和5（b）中的樣品由從鋁酸鑭的薄單晶晶片獲得的相同視場(chǎng)組成，一種鈣鈦礦，通常用作高溫超導陶瓷外延薄膜沉積的基質(zhì)。這些晶體中的孿晶阻礙了薄膜的形成，并可能對所得薄膜的性能產(chǎn)生不利影響。圖5（a）中顯示的數字圖像描繪了當晶體的縱向雙軸平行于傾斜入射光線(xiàn)定向時(shí)，孿晶疇產(chǎn)生的偽浮雕。相反，當晶體（和孿晶）軸旋轉90度時(shí)，使其垂直于入射光線(xiàn)（圖5（b）），孿晶域變得很明顯。這代表了在傾斜照明下觀(guān)察到的樣本取向限制對紋理效果的壯觀(guān)顯示。這些晶體中的孿晶阻礙了薄膜的形成，并可能對所得薄膜的性能產(chǎn)生不利影響。圖5（a）中顯示的數字圖像描繪了當晶體的縱向雙軸平行于傾斜入射光線(xiàn)定向時(shí)，孿晶疇產(chǎn)生的偽浮雕。相反，當晶體（和孿晶）軸旋轉90度時(shí)，使其垂直于入射光線(xiàn)（圖5（b）），孿晶域變得很明顯。這代表了在傾斜照明下觀(guān)察到的樣本取向限制對紋理效果的壯觀(guān)顯示。這些晶體中的孿晶阻礙了薄膜的形成，并可能對所得薄膜的性能產(chǎn)生不利影響。圖5（a）中顯示的數字圖像描繪了當晶體的縱向雙軸平行于傾斜入射光線(xiàn)定向時(shí)，孿晶疇產(chǎn)生的偽浮雕。相反，當晶體（和孿晶）軸旋轉90度時(shí)，使其垂直于入射光線(xiàn)（圖5（b）），孿晶域變得很明顯。這代表了在傾斜照明下觀(guān)察到的樣本取向限制對紋理效果的壯觀(guān)顯示。圖5（a）中顯示的數字圖像描繪了當晶體的縱向雙軸平行于傾斜入射光線(xiàn)定向時(shí)，孿晶疇產(chǎn)生的偽浮雕。相反，當晶體（和孿晶）軸旋轉90度時(shí)，使其垂直于入射光線(xiàn)（圖5（b）），孿晶域變得很明顯。這代表了在傾斜照明下觀(guān)察到的樣本取向限制對紋理效果的壯觀(guān)顯示。圖5（a）中顯示的數字圖像描繪了當晶體的縱向雙軸平行于傾斜入射光線(xiàn)定向時(shí)，孿晶疇產(chǎn)生的偽浮雕。相反，當晶體（和孿晶）軸旋轉90度時(shí)，使其垂直于入射光線(xiàn)（圖5（b）），孿晶域變得很明顯。這代表了在傾斜照明下觀(guān)察到的樣本取向限制對紋理效果的壯觀(guān)顯示。

圖5-試樣外觀(guān)的取向角影響

當在幾個(gè)方向角上傾斜照明觀(guān)察半透明的山羊毛纖維時(shí)，可獲得相似但不太生動(dòng)的結果。當桿狀發(fā)束的長(cháng)軸平行于入射傾斜照明定向時(shí)（圖5（c）），可以看到頭發(fā)纖維的中央部分和邊緣的結構細節。當毛發(fā)纖維垂直于照明軸定向時(shí)（圖5（d）），沒(méi)有這個(gè)細節，并且在兩個(gè)定向角之間觀(guān)察到的纖維表觀(guān)厚度存在顯著(zhù)差異。平行于入射照明定向的纖維似乎比垂直于光源定向的纖維粗得多。

傾斜照明技術(shù)提供的明顯的三維效果并不代表實(shí)際的樣品幾何形狀或形貌，因此不應用于進(jìn)行樣品尺寸的測量。傾斜照明圖像的真實(shí)值在于揭示樣品內的折射率或其他光程差的過(guò)渡，從而可以更清楚地理解形態(tài)和內部結構。該技術(shù)可以應用于在明場(chǎng)照明下看起來(lái)幾乎不可見(jiàn)或透明并且不能被染色或進(jìn)行化學(xué)或熱處理以增強對比度的各種材料。研究活生物體和過(guò)程，例如體外受精，玻璃或丙烯酸纖維，化學(xué)晶體